X
تبلیغات
Parasitology - PCR
انواع PCR:

بمنظور نتیجه گیری بهتر، غیر از PCR معمولی روش های جدیدی از PCR ارائه شده است که به صورت اجمالی به برخی از آنها اشاره می شود.

1- آر تی _ پی سی آر (RT-PCR)

(Reverse Transcriptase-PCR)

الگوی اولیه در RT-PCR، مولکول RNA تک زنجیره ای است. از آنجائیکه DNA پلیمراز قادر به استفاده از RNA بعنوان الگو نمی باشد، مرحله دیگری به PCR اضافه شده است. طی این مرحله، با استفاده از آنزیم رورس ترانس کریپتاز (Reverse Transcriptase) RT ، از الگوی RNA، مکمل آن DNA‌C (complementary DNA)
سنتز می شود و بوسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد. بمنظور تعیین گونه و حساسیت دارویی در ویروس شناسی و مایکوباکتریولوژی، از این روش برای تکثیر RNA ریبوزومی استفاده می شود.

2- نستد – پی سی آر (Nested-PCR)

در این روش بمنظور افزایش حساسیت PCR از دو جفت پرایمر استفاده می شود. ابتدا با یک جفت پرایمر اول در طول 30-15 چرخه، قطعات مشخصی از DNA هدف تکثیر می یابند. سپس محصول PCR حاصل به لوله دیگری منتقل شده و بعنوان الگو استفاده می شود و بوسیله جفت پرایمرهای دوم مرحله دوم PCR انجام می شود.


3 - مالتیپلکس – پی سی آر

(Multiplex-PCR)

در این روش از چند جفت پرایمر اختصاصی برای هدف های مختلف استفاده می شود. در میکروب شناسی بالینی، با استفاده از این روش امکان شناسایی چندین عامل بیماری در یک نمونه بطور همزمان وجود دارد و می توان عفونت های مخلوط را تشخیص داد.


4-آرمز – پی سی آر (ARMS-PCR)

(Amplification Refractory Mutation System-PCR)


روش آرمز _ پی سی آر (ARMS-PCR) برای تشخیص موتاسیون های نقطه ای بکار می رود و از دو جفت پرایمر استفاده می شود. در این روش، واکنش در دو لوله جداگانه انجام می شود که یکی از آنها حاوی پرایمرهای نوع موتاسیون یافته و دیگری حاوی پرایمرهای نوع معمولی است. چنانچه تکثیر در لوله حاوی پرایمر موتاسیون یافته انجام شود، در DNA هدف، موتاسیون اتفاق افتاده است و تکثیر در لوله حاوی پرایمر معمولی، نشان دهنده آن است که موتاسیونی اتفاق نیفتاده است. از این متد می توان در تشخیص موتاسیون های مولد مقاومت دارویی در باکتری‌ها استفاده کرد. 

 " واکنش زنجیره ی پلیمراز "

این تکنِِیک در اواسط دهه ی 1980 بوسیله ی کری مولیس معرفی شد . به دلیل کاربردها و مزیت های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد . امروزه این روش تقریباً در تمامی آزمایشگاهها ی زیست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتیک بوسیله ی کامپیوتر انجام می شود.

این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی  از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد . برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص می بایست این
ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر کنند ولی امروزه این کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند.

PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . یاد آوری می شود که DNA پلیمراز DNA تک رشته ای را از جهت

 5َ     3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت 3َ      5َ

می سازد . همچنین DNA پلیمراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه ( شناساگر ) دارد .

برای انجام PCR ، DNA پلیمراز ، نوکلئوتید تری فسفات ها و پرایمر لازم هستند . از آنجائیکه DNA دو رشته ای است ، دو نوع پرایمر در PCR مورد نیاز است . این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند ، اول اینکه محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می نمایند و دوم اینکه اندازه ی قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است ، در مورد عمل دوم باید گفت که وقتی این دو شناساگر به دو ناحیه ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می گیرند DNA پلیمراز تنها قطعات را در بین این دو ناحیه همانند سازی می کند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین می شود .

برای شروع PCR ، DNA الگو ، پرایمر ها و نوکلئوتید تری فسفات ها و DNA پلیمراز در یک لوله با هم مخلوط می شوند . سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند . سپس لوله را سرد می کنند تا پرایمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پلیمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنماید . بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار دیگر پرایمر ها به نواحی مکمل خود متصل شوند . چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است ، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتیجه در پایان این مرحله بوجود می آید ، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همین صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زیاد می شود .

در ابتدای طراحی PCR  از آنزیم DNA پلیمراز E.coli استفاده شد ولی این آنزیم به حرارت حساس می باشد و بنابراین پس از هر بار حرارت دادن محیط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد ، افزودن دوباره ی آنزیم تازه به محیط لازم بود . یکی از مهم ترین کشفیات در این زمینه این بود که باکتریهای چشمه های آب گرم دارای DNA پلیمراز هایی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعالیت بهتری دارند . برای مثال باکتری  Thermus  aquaticus دارای DNA پلیمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پایدار است و همچنین دمای اپتیمم عمل آن نیز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد ، این DNA پلیمراز که بطور خلاصه Taq پلیمراز نامیده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتیک انجام شود و با افزودن یکبار آنزیم Taq پلیمراز دیگر نیازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .

مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلیمراز افزایش حساسیت و دقت PCR می باشد . در دمای پایین ( 30 درجه سانتی گراد ) ( که برای DNA پلیمراز E.coli بکار می رفت ) پرایمر ها ممکن است به جایگاههایی که توالی تا حدودی مشابه دارند نیز متصل شوند ، زیرا در دمای پایین تعداد کمتری پیوند هیدروژنی برای اتصال پرایمر ها نیاز است . بنابراین پرایمر ها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه ، باعث ایجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند . ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه ( دمای اپتیمم فعالیت Taq پلیمراز )  انجام شود اتصال پرایمر ها به نواحی غیر از ناحِیه ی اصلی کاهش می یابد . به این صورت پس از پایان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد .

برای دیدن قطعات تکثیر شده DNA می توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگامیزی اتیدیوم بروماید استفاده کرد .

·   کاربردهای PCR : 

تکنیک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زیست مولکولی دارد ، علت اصلی این امر این است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامین کرده و مورد استفاده قرار داد .

بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :

1 – تهیه ی  نسخه های متعدد از یک ژن

2 – بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA

 

·  تهیه ی نسخه های متعدد از یک ژن : 

برای این کار بجای اینکه هر دو پرایمر مورد نیاز برای PCR را به یک میزان به محیط واکنش اضافه کنند ، یکی از پرایمر ها را به تعداد کمتر پرایمر دیگر را به تعداد بیشتر اضافه می کنند . در هنگام انجام PCR ، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن یکی از پرایمر ها فقط رشته دیگر که هنوز پرایمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همین دلیل نسخه های بیشتری از این رشته بوجود می آید. پس از پایان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ایجاد خواهد شد که می توان به طور مستقیم در روش سانجر بکار برد .

مثال دیگری از کاربردهای PCR بررسی پیوستگی ژنها و تعیین فاصله ی بین ژنها بر روی کروموزومهای انسان است . در ژنتیک برای تعیین فاصله ی بین ژنها از بررسی تعداد نوترکیبها به نسبت فنوتیپ والدین استفاده می شود . این روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسیار زیاد و دوره ی رشد آن نیز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسیار محدود و با فاصله ی زمانی زیاد می باشد ، این بررسی هابه سختی و با محدودیت بسیار انجام می گیرد . ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جدیدی را برای این کار پیدا کرده اند . برای این کار از بررسی آللهای موجود در یک اسپرم استفاده می شود . از آنجائیکه اسپرمها هاپلوئید بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم یک عدد وجود دارد ، با بررسی همزمان دو ژن بر روی یک کروموزوم و تعیین میزان نوترکیبی بین این دو ژن می توان فاصله ی ژنتیکی بین دو ژن را تعیین کرد . در واقع از نظر ژنتیکی بررسی 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند یک خانواده برابر است . با استفاده از این روش ثابت شده است که میزان نوترکیبی کروموزومها در مردها با میزان نوترکیبی در زنها متفاوت است . 

· بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از DNA : 

به جرات می توان گفت که این کاربرد دوم PCR مهمترین کاربرد آن و علت اصلی

گسترش روزافزون آن در کلیه ی شاخه های علوم زیست مولکولی است . تعدادی از این کاربردها عبارتند از : 

الف ) تشخیص قبل از تولد بیماریهای ژنتیکی :  

در این روش تعدادی از سلولهای جنین را استخراج کرده و با پرایمر اختصاصی برای یک ژن بیماری مجاور می کنند ، همچنین بطور جداگانه با پرایمر ژن سالم نیز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پایان PCR تفسیر آزمایش چنین خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ، جنین یک ژن سالم و یک ژن بیمار دارد یعنی حامل است ولی بیمار نیست . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بیمار وجود دارد انجام شود جنین بیمار است و باید سقط شود . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنین کاملاَ سالم است .

امروزه بسیاری از بیماریهای ژنتیکی مانند هموفیلی ، کم خونی داسی شکل ، سیستیک فیبروزیز (Cystic Fibrosis ) ، تالاسمی ، سندرم لش – نیهان ، دیستروفی عضلانی دوشن ، فاویسم ، فنیل کتون اوری و غیره را می توان به کمک PCR تشخیص داد. 

ب ) تعیین جنسیت جنین : 

برای این کار تعدادی از تخمک های زن را خارج می کنند و در شرایط آزمایشگاهی با اسپرمها آمیزش می دهند و هر یک از سلولهای تخم تشکیل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اینکه جنین به مرحله ی 10 سلولی برسد . سپس از هر جنین یک سلول را جدا کرده و همراه با پرایمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند.سپس PCR و در پایان الکتروفورز انجام می شود . در هر یک از لوله ها که جنین نر ( یعنی کروموزوم y ) وجود داشته باشد ، سنتز DNA صورت می گیرد و در لوله ی دیگر نه . حال جنسیت تمامی جنین ها مشخص می باشد و می توان به اختیار خود پسر یا دختر را انتخاب کرده و جنین مورد نطر را به مادر انتقال داد . امروزه تکنیک فوق علاوه بر تعیین جنسیت برای خانواده هایی که در معرض خطر بیماریهای وابسطه به X ( مانند هموفیلی ) هستند نیز استفاده می شود . به این صورت که جنین ها ی اولیه را از نظر وجود ژن بیمار با استفاده از پرایمر اختصاصی  آن مورد بررسی قرار می دهند و جنین سالم را به مادر منتقل می کنند .

شاید باورنکردنی باشد که تمامی مراحل بالا یعنی استخراج تخمک از مادر ، لقاح ، تکثیر ، PCR و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان یک روز قابل انجام است .

راه دیگر تعیین جنسیت جنین استفاده از خون مادر است . در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنین وارد خون مادر می شوند . حال اگر PCR برای قطعه ی    DYZl ( در حدود 5000 نسخه از این قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد ) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم y ندارد پس این ژن مربوط به کروموزوم y جنین است و جنس جنین نر تعیین می شود .

·  

  بررسی عفونت های باکتریایی و ویروسی : 

هم اکنون در بعضی از آزمایشگاهها از PCR برای تشخیص ایدز استفاده می کنند. برای این کار از خون محیطی نمونه گیری می کنند و از توالی های اختصاصی ویروس HIV نیز به عنوان شناساگر استفاده می کنند ، سنتز DNA نشان دهنده ی عفونت ایدز است.

استفاده دیگر PCR در تشخیص بیماری سل می باشد . مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یک باکتری بسیار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمایشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بیماری سل از نمونه ی خلط فرد بیمار به همراه پرایمرهایی که برای توالی خاص مایکوباکتریومهای مکمل می باشند ، مورد استفاده قرار می گیرد . پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوشهای مختلف مایکوباکتریومها قرار می گیرد و به این صورت گونه و سوش آن تشخیص داده می شود .

 

·   تشخیص جهش ها و سرطان ها : 

در هر سلول معمولاَ از یک ژن فقط یک نسخه وجود دارد ، و در صورتی که این ژن دچار جهش شود بررسی این جهش بسیار مشکل خواهد بود ، زیرا در سلولهای انسان پیدا کردن یک ژن در میان کل ژنوم انسان ، همانند پیدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پیدا کردن ژن جهش یافته نیز به دلیل محدودیت نسخه های این ژن بررسی کمیت و کیفیت جهش در آن مشکل خواد بود .

ولی امروزه PCR کار را بسیار راحت نموده است . کافی است که یک سالم و یک سلول جهش یافته بطور جداگانه برای یک ژن خاص تحت PCR  قرار گیرند و محصولات حاصل با هم مقایسه شوند . به این ترتیب به راحتی می توان محل جهش ، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم دیگر را به دست آورد .

استفاده دیگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد . داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سیتوتوکسیک می باشد که عوارض جانبی بسیار زیادی به همراه دارند. به همین دلیل نیز سرطان شناسان مایل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بین رفتن سلول بدخیم درمان را متوقف نمایند ، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد ، احتمال عود مجدد بیماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعیین سلولهای سرطانی بسیار بالا می رود که اهمیت آن ناگفته پیداست و به همین دلیل PCR منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت .

·  

  تعیین توالیهای کروموزومی انسان در سلولهای هیبریدی ( هتروکاریونها ) : 

یکی از تکنیکهای بررسی ژنوم انسان ، تلفیق ( هیبرید کردن ) هسته های سلولهای انسانی با سلولهای حیوانات دیگر مثلاَ موش است . پس از انجام تلفیق دو هسته ، کروموزومهای انسان به تدریج حذف می شوند ، تا اینکه نهایتاَ یک کروموزوم در درون هسته هیبریدی باقی می ماند . حال گاهی به منظور بررسی های بیشتر لازم می شود که این قسمتهای ژنوم انسان تکثیر شوند ، مثلاَ وقتی که یک ژن خاص مورد بررسی قرار می گیرد . برای این کار ازنوع خاصی از PCR که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود.

در این روش از پرایمرهایی استفاده می شود که مکمل توالیهای بسیار تکراری ژنوم ها می باشد ، این توالی های 300 جفت بازی که گاهی تا 900000 بار در ژنوم انسان و دیگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند . این توالی ها بسیار متغیر می باشند ولی در انسان قسمتی از این توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همین دلیل به راحتی می توان از آن برای تکثیر قطعات DNA که بین دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد . سپس این DNA را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئین مورد سنتز و یا تعیین توالی و غیره مورد بررسی قرار داد . مهمترین استفاده روش فوق تعیین مکان ژنتیکی ژنهای مختلف برروی کروموزومهای انسان است که تا قبل از این روش تقریباَ

نا ممکن ویا بسیار مشکل بود . 

·   مشکلات PCR : 

با تمامی مزیت های فوق PCR مشکلات خاص خود را دارد . مهمترین مشکل PCR آلودگی نمونه های مورد بررسی است . به دلیل حساسیت فوق العاده و قدرت تکثیر زیاد PCR هر قطعه DNA خارجی که وارد محیط PCR شود ، مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج عجیب و دور از واقعیتی به وجود خواهد آورد . برای مثال در مورد تحقیقی که در تعیین جنسیت با استفاده از خون مادران باردار بیان شد ، در بین جوابها یک مورد مثبت کاذب برای یکی از زنان غیر باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود ، وجود داشت . پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچیزی از سلولهای پوست یکی از کارکنان مرد آزمایشگاه وارد لوله ی PCR شده است . گاهی نیز باقیمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثیر DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در این مورد شستشوی زیاد و دقیق مشکل گشا است . 

  واکنش زنجیره ی پلیمراز نسخه برداری معکوس :  RT-PCR 

واکنش زنجیره پلیمراز نسخه برداری معکوس ( RT-PCR ) تعدیلی از واکنش زنجیره پلیمراز PCR ) ) برای تقویت اطلاعات محتوی اسید ریبو نوکلئیک (RNA ) توسط تبدیل آن به DNA و سپس تقویت آن می باشد . رشته ی RNA در ابتدا به صورت معکوس به مکمل DNA خود یا DNA مکمل نسخه برداری می شود و با تقویت DNA حاصله با استفاده از واکنش زنجیره پلیمراز دنبال می گردد . این می تواند یک فرآیند 1 یا 2 مرحله ای باشد .

واکنش زنجیره پلیمراز خودش فرآیندی است که برای تقویت نمونه های DNA بکار می رود ، از طریق پلیمراز DNA با واسطه ی حرارت .

PCR نسخه برداری معکوس نباید با واکنش زنجیره پلیمراز زمان واقعی که غالباَ به صورت RT-PCR خرید و فروش می شود ، اشتباه شود

+ نوشته شده در  دوشنبه سوم آبان 1389ساعت 2:44 PM  توسط امین احمدی   |