انواع فیکساتورها و نگهدارنده ها:

1-فرمالین 5% و 10 %  برای نگهداری نمونه ( مدفوع ،تخم ،کرم ،لارو و کیست ) به نسبت 1 : 3

2- محلول نمکی فرمل 5 %برای نگهداری کیست ،تخم لارو جهت نگهداری طولانی مدت 

3- محلول بافر فرمل 10 % برای نگهداری طولانی مدت نمونه ها می باشد که میتوان جهت ازمایش فلوتاسیون  و تغلیظ نیز استفاده نمود.

طرز تهیه فرمالین 5 % : مقدار 5 میلی لیتر فرمالدئیدرا در 95 میلی لیترآب مقطرحل می نماییم .

 طرز تهیه محلول نمکی فرمالین 5 %  : 5 میلی لیتر فرم آلدئیدرا در 95 میلی لیتر سرم فیزیولوزی 0.85 % حل می نماییم.

از محلول لوگل بعنوان فیکساتیو و رنگ کننده میتوان استفاده نمود.

طرز تهیه محلول لوگل : 10 گرم (KI) + 5 گرم (I) + 100میلی لیتر آب مقطر

نکات مهم:

1-  در نماتودها از فرمالین بعنوان فیکساتیو نباید استفاده کرد.چون نفوذ آن تدریجی است و باعث سفتی و خشکی نمونه  می شود. نماتودها را اول درآب گرم کشته و بعد سریعا به داخل نگهدارنده مناسب ( الکل-گلیسرین 5% )می گذاریم. اما از محلول 2-1 %  فرمالین  برای کشتن نماتودها میتوان استفاده نمود.

2-در ترماتودها بهترین فیکساتیو  AFA  (الکل- فرم آلدئید-اسید استیک ) می باشد که پس از 24 ساعت به محلول الکل گلیسرین 5 % باید منتقل نمود .

  طرز تهیه AFA  (الکل- فرم آلدئید-اسید استیک )  : 10میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه + 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال + 45 میلی لیتر آب مقطر

رنگ آمیزی کرمها به روش کارمن اسید:

مواد مورد نیاز : 45 میلی لیتر اسید استیک + 55 میلی لیتر آب مقطر+ 5 گرم پودر رنگ

 طرز تهیه رنگ کارمن : پودر رنگ را به اسید و آب مقطر اضافه نموده و مدت 15 دقیقه می جوشانیم.محلول را سرد کره وصاف می نماییم. مایع صاف شده بعنوان Stock  استفاده می گردد.

 روش رنگ آمیزی

1-      انگل را حداقل بمدت 24 ساعت در ثابت کننده  قرار می دهیم.

2-      با آب معمولی نمونه را شسته تا ماده ثابت کننده خارج گردد.

3-      بسته به ضخامت کرم نمونه را در رنگ کارمن اسید  به مدت 6-2 ساعت قرار می دهیم.

4-      نمونه را از رنگ خارج کرده و با آب بمدت 15 دقیقه شستشو می دهیم.

5-      نمونه را در الکلهای 30-50و  70 درجه  بمدت 60-30 دقیقه قرار می دهیم تا آبگیری شود.

6-      نمونه را در اسید الکل 1 % قرار می دهیم تا رنگ اضافه خارج گردد.

7-      نمونه را در الکل 70 درجه بمدت 3-2 ساعت  قرار می دهیم .

8-      در الکل 80 و سپس در الکل مطلق بمدت 1 ساعت قرار می دهیم.

9-      نمونه را در مخلوط 50 % الکل اتیلیک مطلق و 50 % گزیلول بمدت 30 دقیقه قرار می دهیم

10-  نمونه را در گزیلول خالص قرار می دهیم.

11-  نمونه را با استفاده از کانادا بالزام مونته می نماییم(می چسبانیم).

طرز تهیه چسب  کانادا بالزام :  200 گرم کلرال هیدراته + 20 میلی لیتر گلیسرین + 30 گرم صمغ عربی + 50 میلی لیتر آب مقطر

روش نگهداری نمونه های مربوط به بند پایان:

1)      نگهداری مرطوب : برای نگهداری مرطوب از اتانول 80-70 درجه استفاده می گردد.

2)      نگهداری خشک : برای معدوم کردن بندپا از اتر ،کلروفرم استفاده می گردد. پس از بی جان شدن، بوسیله سنجاق نازک آنرا به پایه هایی وصل نموده و سرانجام داخل جعبه ای قرار می دهیم،تا خشک شود.

روش شفاف سازی بند پایان:

ابتدا بندپای مورد نظر یا قطعاتی از بدن آنرا از الکل خارج نموده و در یک لوله آزمایش محتوی پتاس 10-5 % به مدت 24 ساعت  قرار می دهیم .میتوان لوله آزمایش حاوی نمونه و پتاس را در ظرفی که حاوی آب است قرار داده و به کمک حرارت آنرا جوشانید .این عمل برای کاهش زمان می باشد. بعد از شفاف شدن نمونه را در آب قرار داده تا پتاس اضافی ازآن خارج گردد.همچنین بقایای هیدرولیز شده نیز در این روش جدا می شود .سپس نمونه را در ظروف حاوی الکل با غلظتهای رو به افزایش ( 50-70-80-96 و الکل مطلق )قرار داده و سپس در مخلوط الکل –گزیلول به نسبت مساوی وارد نموده و سرانجام در گزیلول خالص قرار می دهیم.در نهایت نمونه را روی لام که ماده مانت کانادابالزام ریخته شده قرار داده و با یک لام تمیزآنرا می پوشانیم.

روش مشاهده آمیبها و تک یاخته ها با استفاده از رنگ گیمسا:

 مواد و وسایل مورد نیاز : 1)الکل متیلیک مطلق 2)رنگ گیمسا 3)میکروسکوپ نوری 4)لام  5)روغن سدر

روش آزمایش

پس از تهیه گسترش از نمونه مدفوع آن را کنار گذاشته تا در مجاورت هوا خشک شود .با استفاده از متانول 96 درجه گسترش را  Fix  می کنیم .بعد از خشک شدن رنگ گیمسا ی غلیظ را به نسبت 1 به 20 با آب مقطر رقیق نموده و روی لام می ریزیم .بعد از 15 دقیقه (بسته به غلظت رنگ ) لام را شسته وبعد از خشک شدن یک قطره روغن سدر روی لام ریخته زیر میکروسکوپ با درشتنمایی (  (  100xمشاهده می کنیم .

آزمایش نمونه مدفوع

آزمایش میکروسکوپی

1)روش مستقيم:

کمی از مدفوع تازه را برداشته بر روی یک لام با یک قطره سرم فیزیولوزی  یا آب معمولی رقیق نموده و با قرار دادن یک عدد لامل بر روی آن در زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم. در آزمایش  مستقیم مدفوع علاوه بر بررسی نمونه مدفوع ، آزمایش در یک قطره لوگل 5 % نیز ضروری می باشد .

2)روش رسوبي:

 در این روش حدود 10-5 گرم از مدفوع را در یک لیوان با 100 میلی لیتر سرم فیزیولوژی یا آب معمولی به خوبی مخلوط نموده واز یک توری عبور می دهیم.،تا آشغالهای آن در توری جمع گردد ولی تخم انگل و کیست انگلها از توری عبور کرده و در ظرفی زیر توری جمع گردد. محلول صاف شده را در یک لوله آزمایش ریخته و حدود نیم ساعت به حالت سکون قرار داده تا رسوب در ته لوله ایجاد گردد . پس از ته نشین شدن رسوب ، مایع رویی را خالی کرده و از رسوب آن با قطرات اضافی  کنار لوله بصورت محلول در می آوریم.و یک قطره از آنرا برداشته روی لام قرار داده ویک عدد لامل روی آن گذاشته و زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم.      

روش مشاهده کریپتوسپوریدیوم  و ایزوسپورابلی  در مدفوع  با استفاده از رنگ زیل- نلسون اصلاح شده :

1- گسترش را از نمونه تازه و یا فیکسه شده با فرمالین تهیه می نماییم.

2-گسترس را با متانول یا حرارت  بمدت 5-2 دقیقه فیکسه می نماییم.

3-با کربول فوشین گسترش را بمدت 30-20 دقیقه رنگ امیزی می نماییم. 

4-گسترش را باآب معمولی می شوییم.

5-به کمک اسید سولفوریک 5 % بمدت 60-20 ثانیه رنگ زدایی می کنیم.

6-گسترش را با آب معمولی می شوییم

7-به وسیله مالاشیت گرین ویا متیلن بلو(5 / 0%) بمدت 5 تا 4 دقیقه گسترش را رنگ می نماییم.

8-گسترش رنگ شده را شسته و در هوای آزمایشگاه خشک می نماییم.

اووسیست  کریپتوسپوریدیم  به رنگ قرمز در زمینه سبز یا آبی دیده می شود ،و در اووسیستها گرانول تیره رنگ مشاهده می شود.اسپوروبلاست در ایزوسپورابلی   رنگ قرمز به خود می گیرد.

+ نوشته شده در  سه شنبه چهارم آبان 1389ساعت 10:4 PM  توسط امین احمدی   |